In einer Reihe von Experimenten mit menschlichen krebszelllinien, Wissenschaftler an der Johns Hopkins Medicine sagen, Sie haben erfolgreich das Licht als trigger, um präzise Schnitte in genomischen material schnell, über ein molekulares Skalpell, bekannt als CRISPR, und beobachten, wie spezialisierte Zelle Proteine reparieren die genaue Stelle, wo das gen ausgeschnitten wurde.
Ergebnisse der Experimente, veröffentlicht im Juni 11 in der Wissenschaft, nicht nur offenbaren neue details über die DNA-Reparatur-Prozess, sondern auch wahrscheinlich sind, sagen die Forscher, zu beschleunigen und Hilfe, Verständnis der DNA-Aktivität, die in der Regel bewirkt, dass Altern und viele Krebsarten.
„Unser neues system der gen-editing ermöglicht eine gezielte DNA-schneiden innerhalb von Sekunden nach der Aktivierung. Mit den bisherigen Technologien, gen-editing könnte viel länger dauern—sogar Stunden“, sagt Postdoc Yang Liu, Ph. D., ein Mitglied der Johns Hopkins Medicine research-team.
Die leistungsstarke CRISPR-tool hat in den letzten Jahren, aktiviert Wissenschaftler, um leicht zu ändern, oder „Bearbeiten“,“ DNA-Sequenzen und alter-gen-Funktionen zu beschleunigen das Tempo der Forschung an gen-verknüpften Bedingungen.
Angepasst von einem natürlich vorkommenden gen-editing-system in Bakterien gefunden, CRISPR verwendet kleine Sequenzen von genetischem material namens RNA, die als eine Art Leitfaden, der codiert ist, um zu entsprechen, und eine Bindung an eine spezifische Sequenz der genomischen DNA innerhalb einer Zelle. Die CRISPR-Molekül enthält auch ein Enzym namens Cas9, das wirkt wie das Skalpell zum Ausschneiden der DNA-Sequenz. Dann nutzt die Zelle Ihre eigenen Enzyme und Proteine reparieren die geschnittenen DNA, die oft Zugabe von DNA-Sequenzen, die Wissenschaftler schlüpfen Sie in die Zelle.
Liu sagt, dass die Untersuchung der DNA-Reparatur-Prozess wurde behindert durch die Unfähigkeit, schädigen die DNA, wie durch die Verwendung von CRISPR, in einer Weise, die schnell, präzise und „on demand“.
Für die neuen Experimente, die Wissenschaftler veränderten die CRISPR-Cas9-Komplex durch die Konstruktion einer Licht-sensitiven RNA-Moleküls erlaubt, dass die CRISPR-Komplex zu schneiden genomischer DNA in lebenden Zellen nur, wenn Sie freigelegt, um eine bestimmte Wellenlänge des Lichts.
„Der Vorteil unserer Technik ist, dass Forscher können das CRISPR Maschinen getroffen, ohne vorzeitig zu schneiden das gen, holding back Aktion bis zu dem Licht ausgesetzt sind“, sagt Johns Hopkins M. D.-Ph. D.-Kandidat Roger Zou, auch ein Mitglied des research-Teams. „Damit können die Forscher haben weit mehr Kontrolle über genau, wo und Wann die DNA geschnitten wird“, fügt er hinzu.
Andere teams haben experimentiert mit beiden Medikamenten und leichte Aktivierung zu kontrollieren CRISPR timing, sagt Taekjip Ha, Ph. D., Bloomberg Distinguished Professor für Biophysik und Biophysikalische Chemie, Biophysik und Biomedizinische Technik an der Johns Hopkins University und dem Howard Hughes Medical Institute investigator. Sein team die Experimente unterscheiden sich durch die Verbesserung der genaue Zeitpunkt CRISPR Schnitte und untersucht, wie schnell Proteine reparieren die Schäden an der DNA.
Für die aktuelle Studie, die Johns Hopkins-team, geführt von Ha und Bin Wu, Ph. D., assistant professor für Biophysik und biophysikalische Chemie an der Johns Hopkins University School of Medicine, lieferte einen elektrischen Impuls zu Kulturen von humanen embryonalen Nieren-Zellen, und Knochen-Krebs-Zellen, die geöffneten Poren in der Zellmembran und erlaubt die CRISPR-Komplex mit der Licht-aktivierten RNA-Molekül zu schieben in die Zellen. Die Forscher warteten 12 Stunden für die CRISPR-Komplex zu binden, um einen gezielten Punkt auf der genomischen DNA.
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Wenn Sie leuchtete ein Licht auf die Zellen, verfolgten Sie die Zeit, die es dauerte, für die CRISPR-Komplex um den Schnitt zu machen.
Das team fand heraus, dass innerhalb von 30 Sekunden das Licht auf die Zellen, die CRISPR-Komplex geschnitten hatte mehr als 50 Prozent Ihrer Ziele.
Weiter zu prüfen, das timing der DNA-Reparatur, die Johns Hopkins Wissenschaftler verfolgt, wenn Proteine, die in DNA-Reparatur eingeklinkt, um die DNA schneidet. Sie bestimmt, dass die Reparatur-Proteine begonnen, Ihre Arbeit innerhalb von zwei Minuten die CRISPR activation, und die Reparatur war abgeschlossen Sie so früh wie 15 Minuten später.
„Wir haben gezeigt, dass light-activated gene-schneiden ist sehr schnell, und es hat potenziell Breite Anwendungen in der biomedizinischen Forschung.“, sagt Ha. „Die Enthüllung der Zeitpunkt der CRISPR-gen schneidet, erlaubt es uns, biologische Prozesse deutlich präziser.“ Ha und der Johns-Hopkins-team nannte die Technik „sehr schnell CRISPR-on-demand.“
Ha auch darauf hingewiesen, dass light-activation bietet bessere Lage, die Kontrolle über Medikamente, die diffundieren können weit in die Zelle.
Die Johns Hopkins-team auch verwendet, hochauflösende Mikroskope, um zu „sehen“, wie Reparatur-Proteine interagieren mit der CRISPR-cut-site in lebenden Zellen.
Sie verwendet diese Mikroskope und einen fokussierten Strahl von Licht zu zeigen, die Sie aktivieren könnten CRISPR schneiden von zwei gen-Kopien, die normalerweise gefunden in den menschlichen Zellen. Diese Fähigkeit, sagen Sie, bietet Möglichkeiten für die Verwendung von CRISPR, um zu studieren und schließlich die Behandlung von Bedingungen im Zusammenhang mit nur eine abnorme gen-Kopie, wie die Huntington-Krankheit.
„Es ist eine große Forschung-community interessiert das Studium von DNA-Schäden und Ihre Auswirkungen“, sagt Ha. „Die Technologie, die wir entwickelt haben, ist gut geeignet, um zu studieren.“
Ha stellt fest, dass Wissenschaftler in der Regel die Verwendung ionisierender Strahlung oder Chemikalien zur Untersuchung von DNA-Schäden. Während diese Methoden können auch schnell sein, er sagt, Sie sind nicht spezifisch für eine bestimmte genomische Lage.